限制性核酸内切酶作用于磷酸二酯键。

限制性核酸内切酶（以下简称限制酶）：限制酶主要存在于微生物中。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶。发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。

目前已经发现了200多种限制酶，它们的切点各不相内同。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。在基因工容程中起作用。